Análisis del proteoma de los Exosomas
Este artículo ha sido traducido y publicado con el permiso del autor bajo la responsabilidad de FUJIFILM Wako Pure Chemical.
Artículo original escrito by Koji Ueda Project for Personalized Cancer Medicine, Cancer Precision Medicine Center, Japanese Foundation for Cancer Research, Japan. (Wako Blog 2019).
Los exosomas son microvesículas secretoras derivadas del tráfico vesicular intracelular, las cuales están involucradas en la liberación extracelular de moléculas no deseadas o entrega de moléculas a células distantes. Los exosomas se caracterizan por tener una membrana con bicapa lipídica con un diámetro en el rango de varias decenas a cientos de nanómetros. Los grupos proteicos específicos (familia tetraspanina, familia Rab, Tsg101 y Alix) y miRNAs son abundantes en los exosomas en comparación con las proporciones en la composición celular. Sin embargo, la definición bioquímica de los exosomas no ha sido determinada claramente todavía. De hecho, análisis multi-ómicos basados en el tamaño de las partículas de las vesículas extracelulares reveló que la composición molecular de los exosomas difiere notablemente dependiendo del tamaño de la misma 1). A pesar de la definición incierta de los exosomas, los análisis funcionales utilizando diferentes técnicas de purificación de exosomas (muestras de exosoma con diferentes grados de purezas) se han llevado a cabo en todo el mundo, y se ha reportado la participación de exosomas durante la metástasis en cáncer, invasión, angiogénesis y control de células inmunes.
Por otro lado, es un hecho que los perfiles moleculares de células patógenas pueden leerse a partir de exosomas patógenos derivados de células liberadas en fluidos corporales como la sangre periférica. Por otra parte, ha habido un aumento en el uso comercial de los exosomas para diagnóstico. Se ha desarrollado una prueba (ExoDx Prostate IntelliScore) en el laboratorio CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) para detectar simultáneamente tres ARNs específicos en Cáncer de próstata extraídos de exosomas de muestras de orina: PCA3 ARN no codificante, ARNm ERG y ARNm SDEF. Actualmente la empresa de diagnóstico de exosomas LDT (Laboratory Developed Tests: diseña, fabrica y utiliza pruebas de diagnóstico in vitro dentro de un laboratorio) está disponible internacionalmente 2). Esta compañía también ha desarrollado una tecnología para aislar ADN/ARN exosómico y ADNcf (ADN libre circulante) del plasma en un solo paso, e introdujo una prueba para detectar la mutación EGFR-T790M de células no pequeñas en cáncer de pulmón de muestras de sangre (ExoDx EGFR T790M).
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Esta mutación causa resistencia al tratamiento en aproximadamente 60% de los pacientes con cáncer de pulmón que son tratados con inhibidores de EGFR; por lo tanto, se considera importante adquirir un diagnóstico rápido a la resistencia a las mutaciones EGFR para determinar la transición a medicamentos más efectivos como el osimertinib. Un estudio comparativo con ADNc (cobas®Prueba de mutación EGFR v2) o la prueba ExoDx EGFR T790M fue realizado en 210 utilizando un método de diagnóstico aprobado en pacientes con cáncer de pulmón portadores de la misma mutación. La sensibilidad y especificidad de la detección de T790M usando cobas® EGFR Prueba de mutación v2 fueron 58% y 80%, respectivamente, mientras que los que usaron la prueba ExoDx EGFR T790M fue del 92% y 89%, respectivamente 3).
Estos resultados sugieren que las herramientas que permiten un aislamiento fácil de los exosomas con alta pureza y reproducibilidad sin diferencias entre instalaciones son esenciales para investigaciones biológicas y estudios clínicos. En particular, las proteínas exosómicas purificadas de muestras de suero y plasma requieren niveles muy altos de eficiencia. El suero y el plasma contienen más de 60 mg/ml de proteínas, incluyendo complejos de alto peso molecular, como las lipoproteínas. Por otra parte, es difícil eliminar las lipoproteínas séricas y varias proteínas libres (IgM, α2-macroglobulina y componentes complementos) incluso después de la sedimentación mediante ultracentrifugación, el cual es un método de purificación de exosoma de uso común. Por lo tanto, cuando las proteínas séricas se purifican mediante sedimentación con ultracentrífuga se someten a un análisis proteómico cuantitativo y exhaustivo mediante LC/MS, las proteínas libres en el suero se encuentran en cantidades mayores y solo unas pocas proteínas derivadas de exosomas son detectable 4).
Varios métodos de purificación de exosomas, como la purificación por afinidad utilizando anticuerpos, precipitación de polímeros, filtración en gel y la recuperación directa de tejido disectado de una solución de inmersión en 5) se utilizan adicionalmente a las sedimentaciones con ultracentrífuga. Sin embargo, el Kit MagCapture de aislamiento de exosomas PS (en adelante denominado Kit MagCapture) se basa en la purificación de exosomas mediante afinidad con fosfatidilserina (PS) – un lípido que constituye la membrana externa del exosoma y ofrece varias ventajas sobre los otros métodos. La unión entre la proteína Tim-4 inmovilizada en las esferas magnéticas y PS requiere de ión calcio. Basado en esta característica, es posible aislar exosomas altamente puros mediante elución utilizando un agente quelante sin eluir las proteínas no específicas unidas a las esferas. Adicionalmente, este método es efectivo para el aislamiento de exosomas en muestras con volumen ilimitado y baja concentración directamente mediante las esferas magnéticas. Además, la elución sin desnaturalización es un factor considerablemente importante, que permite una amplia gama de aplicaciones posteriores, como conteo de partículas, microscopía electrónica y administración experimentos celulares.
En la Figura 1 se observan los resultados del análisis integral de proteoma del suero con exosomas utilizando la espectrometría de masas Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Científico). Se identificaron un total de 612 proteínas exosómicas mediante la purificación con ultracentrifugación, mientras que con el kit MagCapture fueron identificadas 1.103 proteínas proporcionando un número de identificación de proteínas 1.8 veces mayor (Figura 1B). Como fue mencionado anteriormente, la sedimentación mediante ultracentrifugación no eliminó varias proteínas libres en el suero, lo que resultó en un encubrimiento del rastro dejado por las señales derivadas de exosomas. Además, encontramos que tanto el número de proteínas marcadoras de exosomas y sus concentraciones relativas fueron más alto en los exosomas purificados por el Kit MagCapture que aquellos purificado por ultracentrifugación (Figura 2).
Esto sugiere que la pureza de los exosomas obtenidos usando el kit es más alto que el método existente de sedimentación mediante ultracentrifugación.
El uso de exosomas altamente purificados tiene grandes ventajas y es confiable para esclarecer las funciones de los exosomas y explorar sus usos en la producción de drogas diagnósticas y terapéuticas. En este sentido, el Kit MagCapture puede servir como punto de referencia para todos los estudios de exosomas desde los puntos de vista de pureza, versatilidad y reproducibilidad. Sin embargo, los productos recuperados por el kit son una colección de estructuras de tamaño independiente que contienen componentes ricos en PS en su membrana y deben ser cuidadosamente evaluados y definidos para futuros análisis ómnicos para determinar si son equivalentes a los exosomas mencionados en otros estudios existentes. Con el desarrollo de métodos de purificación que incluyen el Kit MagCapture, así como métodos para detectarlos, esperamos avances adicionales en los estudios de exosomas y sus usos clínicos.
Referencias:
- Zhang, H. et al.:"Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation", Nat. Cell Biol., 20, 332（2018.
- McKiernan, J. et al.:"A Novel Urine Exosome Gene Expression Assay to Predict Highgrade Prostate Cancer at Initial Biopsy", JAMA. Oncol., 2, 882（2016.
- Castellanos-Rizaldos, E. et al.:"Exosome based Detection of EGFR T790M in Plasma from Non-Small Cell Lung Cancer Patients", Clin. Cancer Res., DOI: 10.1158/1078-0432. CCR-17- 3369（2018).
- Ueda, K.: "The proteomic profile of exosome as a resource of biomarkers", Cell Technology, 32，71（2013).
- Jingushi, K. et al.:"Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin", Int. J. Cancer, 142, 607 2018).
