9 reactivos para laboratorio y su aplicaciones en la investigación

Los reactivos químicos que se utilizan en la investigación van desde moléculas muy pequeñas y de fácil obtención hasta otras muy complejas y más difíciles de obtener.

En este artículo describimos las aplicaciones de nueve reactivos químicos y su aplicaciones en la investigación, dichos reactivos son comercializados por Wako, empresa fabricante y distribuidora de insumos, kit para diagnósticos clínicos y reactivos para laboratorio.

Agosterol A

En 1998 fue aislado un esteroide polihidroxilado de una esponja marina (Spongia sp.), al que se le conoce como Agosterol A. Desde que se realizó su caracterización los investigadores encontraron que revertía la resistencia a los fármacos que se produce en los pacientes con cáncer sometidos a quimioterapia.

La resistencia a la terapia con fármacos anticancerígenos se produce por la sobreexpresión de la llamada proteína 1 (multidrug resistance protein 1 (MRP1)) humana, en células donde la resistencia no está mediada por la P-glicoproteína.

Desde que este compuesto se empezó a comercializar se han realizado diversas investigaciones para estudiar su efecto en la terapia anticancerígena. Se ha estudiado, por ejemplo, su efecto en terapia con fármacos anticancerígenos como la vincristina y la colchicina, donde disminuye la resistencia a los fármacos, inhibiendo directamente el flujo de los fármacos hacia la P-glicoproteína y/o la MRP1.

El mismo grupo de investigadores que aisló el Agosterol A, demostró con el uso de esta molécula, cuál era el sitio que el anclaje del glutation a la MRP1, ya que se conocía que la resistencia a los fármacos dependía de la concentración de glutation en el medio, pero aún no se había esclarecido el mecanismo.

Dismutasa Superóxida (Tipo Mn)

La dismutasa superóxida dependiente de manganeso (MnSOD), debe su nombre a que cataliza la reacción de dismutación de los aniones superóxidos a nivel celular, y se diferencia de otras enzimas de esta familia porque necesita como cofactor para ejercer su función al catión manganeso.

Los investigadores de Wako han llegado a la conclusión que aunque la MnSOD pueda tener actividad incluso antes de su localización en la mitocondria, esta es necesaria para lograr la resistencia al estrés oxidativo.

Cuando la MnSOD es transportada a la mitocondria, permite a la célula captar las moléculas que contienen oxígeno reactivo generadas en el interior y el exterior de la misma.4a Esta enzima está asociada a la defensa de los organismos contra los procesos de oxidación, es por ello que es ampliamente utilizada en la investigación de enfermedades asociadas a la presencia de especies oxidantes. Se usa para investigar la obesidad y como biomarcador de procesos oxidativos e inflamatorios.

Esta molécula también ha servido para estudiar el mecanismo de acción de otros fármacos en el organismo humano. Un ejemplo de ello es el estudio llevado a cabo con la rapamicina, fármaco inmunosupresor utilizado en pacientes transplantados, con cáncer y en procesos relacionados con el envejecimiento. Se conocía que en células normales el efecto protector de la proteína captadora de este fármaco en mamíferos es mediado por el aumento en la expresión de MnSOD, pero en células cancerosas no. El objetivo de este estudio es aprovechar la diferencia de comportamiento del fármaco frente a células cancerosas y células normales, para lograr la protección de estas últimas.

Anticuerpo monoclonal Anti-AGO2 humana

El anticuerpo monoclonal contra la proteína Argonauta2 (AGO2) humana ha sido desarrollado por Wako principalmente para el uso en investigaciones relacionadas con moléculas de microRNA. Uno de los pasos claves para la formación de algunas de las moléculas de microRNA (proteínas de cadena corta de gran importancia en la regulación de la expresión de los genes) está regulado por la proteína Argonauta2, ribonucleasa localizada en los cuerpos P del citoplasma. Para la determinación de las funciones del micro RNA se utiliza el complejo formado por estas moléculas con las proteínas del tipo Argonauta. Este anticuerpo monoclonal puede usarse para la precipitación de la proteína Argonauta2 humana mediante la técnica de inmunoprecipitación usando como método de visualización la tinción con plata o el Western Blot.

El anticuerpo monoclonal contra la proteína Argonauta2 humana ha permitido desarrollar estudios para entender el papel que juega el RNA en la regulación de la inducción de células madres pluripotentes, observándose que los niveles de microRNA en la célula están directamente relacionados con la eficiencia en la inducción de células madres y también su función en el proceso de reprogramación celular. Además se ha llevado a cabo la descripción de los sitios de unión de la proteína Argonauta2 en células madres embrionarias de ratón. Otros investigadores también describieron la relación entre las proteínas del tipo Argonauta presentes en los humanos y su relación con diversos tipos de RNA, incluso cadenas que no son de microRNA, para ello fue necesario hacer uso de este anticuerpo y de otros que se unen específicamente a otras proteínas de la familia.

3-(1-Anilinoetiliden)-5-bencilpirrolidina-2,4-diona

Este reactivo es comercializado por Wako con el nombre de TN-16 y se utiliza como agente de sincronización celular.

Posibilita el establecimiento de ciclos en los cultivos celulares, por lo que es usado en el estudio de mecanismos de proliferación celular de células huéspedes. Su aplicación se extiende a campos como la transformación genética, el estudio de virus, de ácidos nucleicos y del cáncer. Al inhibir la división celular, se usa para lograr la acumulación de células durante la fase mitótica en cultivos sincronizados.

Tiene como ventaja frente a otros sincronizadores celulares convencionales que el restablecimiento de la división celular, una vez lavado el cultivo para eliminar el reactivo del medio, se restablece con mayor facilidad.

Bialaphos

Wako comercializa la sal sódica de Bialaphos, antibiótico producido por la actinobacteria del género Streptomyces. Esta molécula es un péptido formado por dos residuos de alanina unidos a un glufosinato, molécula análoga al ácido glutámico. El Bialaphos actúa como inhibidor de la glutamina sintetasa, enzima que participa en el metabolismo del nitrógeno catalizando la reacción mediante la cual un nitrógeno proveniente de amoníaco se une a la molécula de glutamato dando lugar a la glutamina. Este reactivo es activado cuando es atacado por las peptidasas, que rompen el enlace de las alaninas con el glufosinato que es la molécula activa. El glufosinato debe su toxicidad a la inhibición de la glutamina sintetasa, que hace que se acumule el amoníaco en las células, por lo que esta molécula se comercializa como herbicida no selectivo.

El Bialaphos se utiliza en investigaciones tanto por sus propiedades como antibiótico como por ser precursor del glufosinato. Además se ha descubierto que algunos microorganismos son capaces de acetilar el grupo amino del Bialaphos y del glufosinato, el gen que codifica la enzima que cataliza esta reacción se ha logrado aislar y se utiliza en estudios de resistencia de plantas a este herbicida. También se han estudiado levaduras modificadas genéticamente que presentan una alta resistencia al Bialaphos, estas células sirven para diversos estudios.

NCDM-32b

El NCDM-32b, es un reactivo inhibidor de la histona deacetilasa perteneciente al dominio de Jumonji 2 (JMJD2C). Las histonas son enzimas que participan en procesos de crecimiento, en el desarrollo y diferenciación de embriones y en la regulación de la expresión genética. El gen JMJD2C está asociado con el desarrollo de diferentes tipos de carcinomas en humanos, por lo tanto los inhibidores de JMJD2C son candidatos a agentes anticancerígenos y una herramienta muy potente para dilucidar el mecanismo de acción de estos genes. Con este reactivo se han llevado a cabo investigaciones relacionadas con el carcinoma de esófago, el cáncer de colon, de senos y la leucemia.

Los inhibidores de JMJD2C también pueden alterar la función de otras factores transcripcionales y tener efectos en proteínas no histonas, lo cual aumenta el interés de este reactivo para la investigación. El NCDM-32b es comercializado exclusivamente por Wako.

4,2',4'-Trihidroxichalcona

La 4,2’,4'-trihidroxichalcona también llamada isoliquiritigenina es una chalcona natural extraída en este caso de la raíces de regaliz. Este producto proviene de la medicina tradicional china y ha sido objeto de numerosas investigaciones debido a su efecto antitumoral.

Además presenta otras propiedades farmacológicas como antialérgico, antioxidante y antiinflamatorio. Se ha comprobado que la actividad antitumoral de la isoliquiritigenina es muy diversa. Incluye por ejemplo la inducción de la apoptosis en células cancerígenas humanas gástricas y la inhibición de cáncer de mama y de colon en modelos de roedores. También actúa como fármaco para prevenir el cáncer mediante la inducción de enzimas de fase II que protegen a las células contra especies reactivas, tóxicas o potencialmente cancerígenas.

Como consecuencia de su metabolismo en el organismo humano puede presentar interacción con otros fármacos, se ha especulado que inhibe la acción de la enzima UDP-glucuronosiltransferasa que posibilita la degradación de moléculas lipídicas, entre ellas algunos fármacos a metabolitos excretables. Se ha encontrado además que su efecto hipnótico lo ejerce por modulación alostérica positiva de los receptores de ácido y-aminobutírico de tipo A, específicamente los receptores GABA(A)-benzodiazepina. Por todas las posibilidades como fármaco y sus posibles interacciones con otras moléculas bioactivas es un reactivo de gran importancia en la investigación.

Estreptolisina O, recombinante

La estreptolisina O es una potente toxina citolítica que es producida por casi todos los microorganismos de la familia de los estreptococos A y algunos de los grupos C y G. La producción de esta toxina por los estreptococos del grupo A está asociada a enfermedades muy comunes como la faringitis o el impetigo y puede ser muy peligrosa por la capacidad de estas bacterias de penetrar en las células epiteliales, causando infecciones generalizadas y resistencia a los antibióticos y anticuerpos. La estreptolisina O está implicada en la modulación de la interacción de los estreptococos con las células epiteliales.

A pesar de las enfermedades que causa esta toxina en el organismo humano, se han investigado los diferentes roles de los dominios de esta proteína para lograr análogos mutantes y desarrollar vacunas de uso humano. Es un potencial agente anticancerígeno, ha sido utilizado para la obtención de genes que logren introducirse dentro de los tumores para matar a las células cancerosas, técnica conocida como terapia del gen suicida. Además se usa en el estudio de liberación de fármacos, porque es capaz de unir a moléculas cargadas y liberarlas en diferentes medios. Esta molécula es objeto de numerosas investigaciones actualmente para terminar de comprender los mecanismos de ataque en los que está implicada y por otro lado aprovechar su toxicidad para eliminar células cancerosas.

Acrilamida Phostag

La acrilamida Phos-tag™ se usa para detectar sustancias fosforiladas, ya que reconoce los grupos monoésteres de fosfato. Phos-tag™ es una molécula funcional que se une específicamente a aniones fosforilados, unida a la acrilamida permite la separación de proteínas fosforiladas. Puede ser usada in vitro en ensayos de detección de quinasas. En el análisis de la fosforilación de proteínas endógenas en células y en tejidos animales, con la ventaja de que no se necesita marcaje isotópico para realizar estos procedimientos.

Funciona con el principio de la SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico), que es la técnica más usada para separar proteínas. Se adiciona, junto con cloruro de manganeso, cuando el gel de SDS-PAGE ya está preparado. Durante el proceso de migración las proteínas fosforiladas se unen a los metales divalentes presentes n la molécula de Phos-tag™. Al efectuarse la unión disminuye la velocidad de migración de las proteínas fosforiladas con respecto a las no fosforiladas, separándose unas de otras. Mediante el uso de este reactivo se logra el reconocimiento de todas las formas fosforiladas de serina, treonina y tirosina. Después de separadas las proteínas, el gel de la electroforesis puede ser utilizado para análisis de Western blot o análisis por Espectrometría de Masa (EM).

Este reactivo ha sido aplicado, en estudios de migración por electroforesis en dos dimensiones, para el análisis de formas fosforiladas de la hnRNPK y pudiéndose distinguir cada una de las formas fosforiladas con el mismo punto isoléctrico. También se logró, por ejemplo, la determinación de la actividad quinasa en cada una de las fracciones de la proteína GST-Dnmt1 obtenida de cerebro de ratón. Para ello a cada una de las fracciones eluidas de una columna de celulosa, se les realizó un ensayo de quinasa in vitro y la actividad quinasa fue determinada por ensayo de Western blot usando Phos-tag™ SDS-PAGE.