Uso de Phos-tag para la evaluación fosfoproteómica

La fosforilación es una modificación postraduccional reversible, clave en los procesos biológicos de organismos procariotas y eucariotas. Ocurre principalmente en los residuos de histidina, ácido glutámico y ácido aspártico en células procariotas; sin embargo en eucariotas, ocurre en serina, treonina y tirosina.

Los cambios en los estados de fosforilación de las proteínas afectan a muchos eventos celulares y están involucrados en numerosas patologías. Es por ello que, en los campos de la biología y la medicina, el proceso de enriquecimiento rápido y específico de la fosforilación natural a partir de muestras biológicas complejas, es de gran importancia.

La fosfoproteómica es el estudio de la fosforilación de las proteínas (FP) que forman parte de la célula o tejido en un estado determinado. En la actualidad, los abordajes fosfoproteómicos constituyen una poderosa herramienta para estudiar las respuestas celulares tanto a nivel global como individual de una proteína determinada. Su principal objetivo mediante la aplicación de las técnicas fosfoproteómicas es la extracción de todas las proteínas fosforiladas de los lisados celulares y/o tejidos para identificar aquellas fosfoproteínas de más bajo nivel de expresión. Además de identificar todas las quinasas y fosfatasas implicadas en estos complejos procesos biológicos.

Entre los métodos más útiles para el estudio de la FP y péptidos se encuentran: el marcaje radioactivo, cromatografía por afinidad utilizando iones metálicos, espectrometría de masas, anticuerpos fosfoespecíficos (AcF) y otros.

Recientemente, la tecnología Phos-tag™se ha desarrollado para superar las desventajas y limitaciones de los AcF. Existen anticuerpos de unión a tirosinas, serinas y treoninas fosforiladas que se utilizan en combinación con ensayos de inmunoprecitación e inmunoblot. Se ha comprobado que algunos fosfoanticuerpos poseen un bajo rendimiento y cierta inespecificidad, con excepción de los que reconocen residuos fosforilados de manera independiente a la secuencia peptídica, por ejemplo, los anticuerpos anti-tirosina.

Phos-tag™es una molécula única diseñada tomando como modelo el dominio catalítico de una fosfatasa alcalina. Sus derivados conjugados con biotina, acrilamida o agarosa forman complejos que pueden capturar, reversible y selectivamente, dianiones de monoéster de fosfato unidos a residuos de serina, treonina y tirosina, en solución acuosa y a valores de pH neutros. Su índice de selectividad aniónica hacia el dianión de fosfato es unas 10.000 veces mayor que su selectividad hacia el monoanión de acetato, lo que permite su uso en el enriquecimiento de compuestos biológicos fosforilados a valores de pH fisiológicos en cortos intervalos de tiempo.

Entender el proceso de fosforilación e identificar todos los sitios fosforilados y las enzimas implicadas es invaluable para el descubrimiento de nuevos fármacos y el diagnóstico de enfermedades así como su pronóstico. Enfermedades como el Alzheimer, en la cual se considera que la toxicidad de β-amiloide está mediada por la proteína Tau fosforilada; o en los diversos tipos de cáncer, en los que la elevada fosforilación de ciertas proteínas es un factor crítico en la metástasis, el desarrollo y progreso de la enfermedad.

La Compañía Wako, una empresa distribuidora de reactivos para laboratorios, ofrece en su catálogo los productos de la serie Phos-tag™ para los investigadores en el campo de la fosfoproteómica. Los que describiremos a continuación:

Phos-tag™ Acrilamida AAL-107, para usar mediante Electroforesis con gel SDS-PAGE, es capaz de separar formas fosforiladas y no fosforiladas simultáneamente. Al poderse utilizar independientemente del tipo y la secuencia de aminoácido, mediante su uso se pueden analizar tanto fosfoproteínas desconocidas como detectar nuevos sitios fosforilados. Además, puede usarse en análisis de Western Blotting, Espectrometría de masas y Electroforesis 2D.

Phos-tag™ Agarosapara la purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad. Constituye una columna de cromatografía para la separación, purificación y concentración de proteínas fosforiladas, las cuales se pueden obtener en condiciones similares a in vivo al ser una columna libre de surfactantes y agentes reductores.

Phos-tag™ Biotinapara la detección de proteínas fosforiladas en membranas PVDF mediante Western Blotting cuenta, a su vez, con 3 productos nombrados Phos-tag™ BTL 104, Phos-tag™ BTL 105 y Phos-tag™BTL 111. Siendo el último, el de mayor sensibilidad. Wako recomienda el uso de este producto cuando no se tienen disponibles los anticuerpos anti-fosforilados sin importar el tipo de fosforilación.

Phos-tag™ SuperSep Gel. El producto es un gel, listo para el uso, en técnicas de electroforesis y con un mecanismo similar al gel SDS-PAGE. Contiene Zinc como metal complementario y tiene alta estabilidad de almacenamiento. Wako recomienda el uso del Marcador preteñido para Proteínas WIDE-VIEW™ III para evitar la distorsión de bandas. Además, realizar un proceso con y sin EDTA antes de la transferencia en Western Blotting. Phos-tag™ SuperSep Gel consta de una amplia variedad de geles específicos para tanques electroforéticos EasySeparator™, Bio-Rad y Life Technologies.

Bibliografía:

1) Chad A. Dumstorf, L. E. (2016). Abstract 3919: Phosphorylation of eIF4E is a critical factor in development and progression of breast cancer in women. Cancer Research, 76(14).

2) Emiko Kinoshita-Kikuta, E. K. (2016). Phosphopeptide Detection with Biotin-Labeled Phos-tag. Phospho-Proteomics, 1355 of the series Methods in Molecular Biology, 17-29.

3) Kinoshita, E. K.-K. (2015). Phos-tag-Based Affinity Chromatography Techniques for Enrichment of the Phosphoproteome. En Protein Modifications in Pathogenic Dysregulation of Signaling (págs. 17-30).

4) López-Villar, E. N.-C.-L. (2008). Metodologías fosfoproteómicas útiles en estudios clínicos. Revisión Inmunología, 27(1), 36-44.

5) Takahiro Horinouchi, K. T. (2016). Using Phos-Tag in Western Blotting Analysis to Evaluate Protein Phosphorylation. Kidney Research, 1397 of the series Methods in Molecular Biology, 267-277.

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