¿Por qué usar el coctel CEPT en mis cultivos de células madre?
Las células madre pluripotenciales inducidas (iPSC por sus siglas en inglés) son células que, tras ser tratadas con determinados factores de transcripción, tienen el potencial de generar células de cualquier tipo de tejido. Se logró producir iPSC de humano en el año 2008, y desde entonces se han considerado de altísimo interés para el estudio de distintas enfermedades, otorgándose el Premio Nobel de Medicina de 2012 a los desarrolladores de esta técnica.
Las iPSC, en principio, pueden expandirse indefinidamente en cultivos y diferenciarse para formar prácticamente cualquier tipo celular humano. Esto les da un altísimo potencial para ayudar en la investigación médica. Facilita el estudio de rutas metabólicas y de señalización específicas, pudiendo también generarse modelos celulares de enfermedades raras. En el área de desarrollo de fármacos permiten llevar a cabo pruebas de eficacia y toxicidad en modelos humanos.
Estos modelos varían en complejidad, abarcando desde células en monocultivo, co-cultivos de distintos tipos generando estructuras complejas similares a los tejidos, hasta estructuras tridimensionales que simulan a los órganos llamadas organoides.
El cultivo de células humanas implica distintas dificultades técnicas, y la investigación con iPSC presenta retos considerables. Por una parte, es importante conservar la estabilidad genómica y la memoria epigenética de una línea pluripotente una vez que esta logró establecerse. Para ello es necesario proveer de los nutrientes que permitan mantener el crecimiento de las células pero eviten su diferenciación, y dar el soporte mecánico adecuado. Una técnica usada es el co-cultivo con fibroblastos, siendo menos demandante la alternativa del uso de matrices extracelulares y un medio químico.
Otros retos existentes están relacionados con el paso de disociación de una línea a células individuales con el fin de expandir, criopreservar o clonarlas. Las células disociadas sufren condiciones de estrés, lo que genera baja supervivencia, una mayor acumulación de anormalidades genéticas y baja eficiencia en la clonación.
En el Laboratorio de Translación de Células Madre de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de los E.E.U.U. se desarrolló una combinación de cuatro moléculas pequeñas, CEPT (Croman 1, Emricasan, Poliaminas y Trans-ISRIB) que mejoran la supervivencia de líneas de iPSC.
El Croman 1 fue seleccionado como el mejor inhibidor tanto de ROCK1 como de ROCK2, que bloquea la contracción celular que en células disociadas puede llevar a la apoptosis y anoikis. Al combinarlo con el pan-inhibidor de caspasa Emricasan, el cual interfiere con la apoptosis, se aumentó la tasa de supervivencia celular.
Al buscar una molécula que ayudara a la supervivencia en condiciones de baja densidad celular, se seleccionó el trans-ISRIB, un inhibidor selectivo de la respuesta integrada al estrés (ISR) que regula la translación de proteínas a nivel de eIF2B (factor de iniciación eucariótico 2B) permitiendo que prosiga la síntesis. Al agregar una mezcla de poliaminas como policationes que estabilizan estructuras celulares y macromoléculas, y modulan algunas funciones como transcripción, traducción y respuesta al estrés se observó un efecto positivo.
La combinación de estos cuatro factores presentó un efecto sinérgico al aumentar la supervivencia celular, la adhesión y la traducción de proteínas en un cultivo. Tras diversos pases, se comprobó que las células mantienen sus marcadores pluripotenciales y pueden diferenciarse al poner las condiciones adecuadas. Al agregar CEPT durante el descongelado, mejoró la viabilidad celular, mientras que al criopreservar las células con CEPT se logró una mejor supervivencia tras tiempos largos de almacenamiento.
En Fujifilm Wako le ofrecemos el coctel CEPT (033-26071), producido bajo licencia del NIH, como una preparación lista para usarse. La preparación puede añadirse al medio de cultivo durante los pases de rutina, criopreservación y descongelamiento, clonación unicelular, procesos de edición de genes e ingeniería de tejidos, mejorando significativamente la supervivencia celular.
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Bibliografía
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Chen, Y., Tristan, C. A., Chen, L., Jovanovic, V. M., Malley, C., Chu, P. H., ... & Singeç, I. (2021). A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature methods, 18(5), 528-541.
