Detección por Citometría de Flujo Convencional, Altamente Sensible, de Vesículas Extracelulares Capturadas Mediante Fosfatidilserina (PS)

Naomi Tsurutani¹, Ken Naruse², WataruNakai³, Takeshi Yoshida^3,4, Diego Diez³, Yuji Miyatake^3,4, Takahiro Nishibu², Ryo Ukekawa², Naoko Imawaka², Masayuki Yamane², Yoshifusa Sadamura² and Rikinari Hanayama^{3, 4, 5}, 1 FUJIFILM Wako Chemicals USA, 2 Life Science Research Laboratories, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, 3 WPI Immunology Frontier Research Center (IFReC), Osaka University, 4 Department of Immunology, Kanazawa University Graduate School of Medical Sciences, 5 PRESTO, Japan Science and Technology Agency (JST).

I. Introducción

Las vesículas extracelulares (VE) y microvesículas sirven como mensajeros entre redes intercelulares, permitiendo el intercambio de componentes celulares entre las células. Las VE transportan lípidos, proteínas y ácidos nucleicos derivados de sus células productoras, y tienen potencial como biomarcadores específicos para tipos de células y estados celulares. La citometría de flujo es una técnica que generalmente se usa para el análisis de marcadores celulares y clasificación, sin embargo, el análisis de VE pequeñas (50 nm a 150 nm) puede ser extremadamente desafiante y frustrante.

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II. Objetivo

Desarrollar un método de análisis por citometría de flujo utilizando Tim 4 y esferas magnéticas inmovilizadas, aprovechando las propiedades de la fosfatidilserina que se une a los Exosomas.

Detectar VE usando las esferas magnéticas en las que el anticuerpo marcador de exosoma está inmovilizado.

III. Principio

Características del producto

• Método simple y fácil utilizando esferas magnéticas.
• Capaz de detectar exosomas de muestras como cultivos celulares y fluidos corporales (plasma, suero, etc.).
• Análisis de flujo rápido en 2.5 horas.

IV. Resultados

1 Análisis de citometría de flujo de exosomas unidos a varias esferas magnéticas

Figura 1. Los exosomas en el sobrenadante de cultivo celular de células K562 fueron aislados usando varias esferas magnéticas (proveedor A) seguido por el análisis con citometría de flujo con anticuerpos marcados con fluorescencia.

2 Análisis de exosomas capturados con PS de varias muestras mediante citometría de flujo

Figura 2. Los exosomas contenidos en el sobrenadante de cultivo celular COLO201, suero humano y plasma humano (plasma con EDTA y plasma heparinizado) fueron aislados con este producto. Seguidamente se realizó el control con isotipo control y el anticuerpo anti CD9 humano marcado con ficoeritrina.

3 Clasificación de exosomas capturados por PS mediante citometría de flujo.

Figura 3. Las EV contenidas en el sobrenadante del cultivo de COLO201 se unieron a las esferas magnéticas inmovilizadas con Tim4 y teñidas con un anticuerpo anti CD63 marcado con fluorescencia. La fracción teñida con el anticuerpo anti CD63 se clasificó con un clasificador de células.

4 Análisis mediante citometría de flujo de la Expresión de la Molécula de Adhesión Celular Epitelial (EpCAM) en exosomas derivados de líneas celulares de cáncer humano.

Figura 4. La correlación entre la cantidad de exosomas con EpCAM positiva y la progresión del cáncer de ovario ha sido reportada (Taylor DD y Gercel Taylor et al., Gynecology Research, 110, 12 21, 2008). En esta figura se observa que los exosomas en el sobrenadante del cultivo celular de células TIG 3 (células normales), células COLO201 (línea celular de cáncer colorrectal) y células MCF 7 (línea celular de cáncer de mama), fueron aislados y analizados con anticuerpos de EpCAM y CD63 mediante citometría de flujo con.

V. Conclusión y discusión

Hemos desarrollado un método con citometría de flujo utilizando la afinidad que tiene la fosfatidilserina (PS) para detectar Exosomas en medios de cultivo celular y muestras de fluidos corporales (suero, plasma). El análisis de citometría de flujo mostró que EpCAM esta presente en exosomas tanto en líneas de células de cáncer de colon y seno. En el futuro, este método contribuirá al desarrollo posterior de la investigación en exosoma relacionada con el cáncer.