Análisis de proteínas fosforiladas usando las técnicas de Phos tag

Este artículo ha sido traducido y publicado con el permiso del autor bajo la responsabilidad de Fujifilm Wako Pure Chemical.

Articulo original escrito por Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, Departamento de Ciencia Molecular Funcional Tohru Koike, Instituto de Ciencias Biomédicas y de la Salud, Universidad de Hiroshima, Kasumi 1-2-3, Hiroshima, Japón (Wako Blog 2019).

Introducción

Las proteínas responsables de las funciones celulares vitales utilizan la fosforilación inducida por quinasas y la desfosforilación inducida por fosfatasas para su activación y desactivación, respectivamente. Gran variedades de enfermedades son causadas por irregularidades en la actividad de las quinasas y fosfatasas. Se han reportado varias anormalidades de quinasas en cáncer y trastornos neurodegenerativos. Por lo tanto, el análisis de la fosforilación de proteínas es un área crítica de investigación que puede conducir a la identificación de las causas de varias enfermedades y pueden ayudar en el desarrollo de inhibidores de quinasas (agentes moleculares objetivo).

Hasta la fecha, hemos desarrollado técnicas para el análisis de fosforilación de proteínas utilizando Phos-tag, una molécula funcional que captura específicamente el grupo fosfato    (-PO₃^2-). Este artículo presenta tres técnicas Phos-tag utilizadas por los investigadores en Ciencias de la Vida.

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Análisis de proteínas fosforiladas utilizando Phos-tag SDS-PAGE

Phos-tag SDS-PAGE es una técnica de electroforesis de afinidad por fosfato que separa proteínas fosforiladas y no fosforiladas utilizando el procedimientos convencional SDS-PAGE ^(1,2). Esta técnica utiliza un gel de separación en el que la acrilamida se copolimeriza con la acrilamida del Phos-tag que es la molécula que atrapa al fosfato.

Los reactivos, la preparación de muestras de proteínas y el funcionamiento de la electroforesis son similares a aquellos para los procedimientos convencionales de SDS-PAGE. Las proteínas fosforiladas se unen la molécula de Phos-tag inmovilizada en el gel durante la electroforesis, lo que ocasiona una migración más lenta comparada con las proteínas no fosforiladas, permitiendo diferenciar las proteínas fosforiladas y las no fosforiladas (Figura 1).

Figura 1. Descripción general de Phos-tag SDS-PAGE.  

Esta técnica de electroforesis permite la separación de las proteínas fosforiladas que contienen un número idéntico de grupos fosfato, pero en diferentes lugares dentro de la misma molécula, lo que resulta en diferentes bandas de migración. Por lo tanto, diversas formas fosforiladas de una sola proteína pueden ser detectadas como múltiples bandas de migración en el gel. Además, Phos-tag SDS-PAGE permite el análisis no solo de las proteínas fosforiladas Ser, Thr y Tyr, sino también de proteínas fosforiladas inestables como His y Asp que están involucradas en un sistema de señalización de dos componentes. Por lo tanto, esta técnica es apropiada para análisis cuantitativos y cualitativos de proteínas con diferentes estados de fosforilación. Debido a la disponibilidad comercial de los geles prefabricados Phos-tag SDS-PAGE (Serie SuperSep Phos-tag), esta técnica puede ser aplicada fácilmente a múltiples estudios de investigación. Las imágenes de bandas de proteínas fosforiladas están disponibles en la colección de datos Phos-tag SDS-PAGE http://www.phostag.hiroshima-u.ac.jp/index(E).html.

Recientemente, analizamos diferentes formas fosforiladas de MEK1 en cáncer usando Phos-tag SDS-PAGE. ⁵⁾  Se han identificado mutaciones características del gen que codifica MEK1 en ciertos cánceres esporádicos y en células cancerosas resistentes a inhibidores de MEK. Phos-tag SDS PAGE reveló que la introducción de mutaciones puede producir especies constitutivamente activas de MEK1 que contienen residuos fosforilados de Ser-218 y Ser-222 (Figura 2) e inducen la actividad esencial de la quinasa. El análisis de la fosforilación en MEK1 puede, por lo tanto, proporcionar información clínica sobre las características de las mutaciones individuales en el gen codificador de MEK1.

Figura 2. Las mutaciones de MEK1 y el aumento de especies fosforiladas de MEK1 en cáncer (tomado de la referencia 5). El estado de fosforilación de los mutantes MEK1 reportados en cáncer de pulmón, de ovario y las líneas celulares resistentes al cáncer fueron analizados con Phos-tag SDS-PAGE.

Análisis de proteínas fosforiladas utilizando Phos-tag Biotina

Phos-tag Biotina puede ser usado como una herramienta molecular en aplicaciones como la transferencia Western Blot o métodos basados ​​en microarrays para la detección integral de proteínas fosforiladas. Con esta técnica, se forma un complejo entre el Phos-tag Biotina y la unión de la Peroxidasa de Rábano (PHR) con el tetrámero de estreptavidina en una relación de 4: 1, seguido por el análisis con membrana de transferencia o microarrays. Las proteínas fosforiladas que se unen específicamente al complejo Phos-tag Biotina son detectadas mediante la reacción quimioluminiscente (ECL) del sustrato y la PHR (Figura 3).

Figura 3. Detección de proteínas fosforiladas en membrana de PVDF o microarrays utilizando Phos-tag Biotina.

Para analizar proteínas fosforiladas utilizando Phos-tag Biotina en conjunto con el sistema ECL, usamos un microarray de anticuerpos disponible en el mercado para perfilar las proteínas (Sistema Human Phospho-MAPK Array, producido por R&D Systems). Este microarray consiste en 52 anticuerpos fosforilados individualmente (26 duplicados) ubicados independientemente sobre una membrana de nitrocelulosa. Nosotros examinamos las proteínas fosforiladas presentes en dos lisados de muestras de células Raw 264.7 antes y después del tratamiento con lipopolisacárido (LPS) y forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (Figura 4). De acuerdo con los resultados de otrosestudios de señalización con LPS / PMA confirmamos el aumento significativo en los niveles de fosforilación de varias proteínas, incluidas Akt2, HSP27 y p38b, utilizando el microarray de anticuerpos sistema con Phos-tag Biotina. Esta técnica permite la detección simultánea del estado de fosforilación de múltiples proteínas en una muestra de lisado.

Figura 4. Detección de proteínas fosforiladas en células Raw 264.7 antes y después de la estimulación con LPS / PMA (reimpresión de la referencia 6). Se utilizo un microarray de anticuerpos (Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array, R&D Sistemas) y Phos-tag Biotina para detectar proteínas fosforiladas en el extracto celular Raw 264.7 estimulado con LPS / PMA. Los puntos 1-6 mostraron una fosforilación significativa después de la estimulación.

Separación y enriquecimiento de proteínas fosforiladas utilizando

Phos-tag Agarosa

Phos-tag Agarosa se puede utilizar como matriz para la cromatografía de afinidad con fosfato. Aunque más del 60% de todas las proteínas celulares pueden ser fosforiladas, los cambio entre los estados de fosforilación y desfosforilación cambian dinámicamente utilizando quinasa y reacciones de fosfatasa, respectivamente. De hecho, el número de proteínas en el estado fosforilado es muy pequeño. Por lo tanto, la técnica de separación y enriquecimiento es muy atractiva y útil para el análisis de dichas proteínas fosforiladas. ⁷⁾

Figura 5. Enriquecimiento de proteínas fosforiladas mediante pretratamiento de extractos de muestras de células usando una columna de centrifugado simple que contiene Phos-tag Agarosa (tomado de la referencia 8). Las células A431 se estimularon con EGF y la fosforilación de SHC fue analizada mediante inmunotransferencia con un anticuerpo SHC anti-fosforilado específico. El pretratamiento con una columna de centrifugado simple que contiene Phos-tag Agarosa permitió la detección clara de las bandas objetivo (66, 52 y 46 kDa).

Hemos utilizado el método Phos-tag Agarose en columna giratoria para analizar proteínas fosforiladas.⁸⁾ En este método, se prepara una columna de centrifugado simple usando un microtubo de 0.5-mL y un 1.5-mL y la columna llena con 20 μl de Phos-tag Agarosa (40 μl de Phos-tag Agarosa viscosa). La Figura 5 muestra la columna de centrifugado simple y una inmunotransferencia con un anticuerpo específico anti-fosfoproteína contra SHC del extracto celular sin y con pretratamiento en la columna de centrifugado simple. Las muestras de extracto celular sin pretratamiento mostraron señales débiles o señales inespecíficas. Por lo tanto, los estados de fosforilación de SHC después de la estimulación con factor de crecimiento epidérmico (EGF) no pudieron ser determinados. Por otro lado, las muestras pretratadas con Phos-tag Agarosa mostraron señales distintas, indicando un aumento en los niveles de SHC fosforilados causados ​​por la estimulación de EGF. Estos resultados demuestran que el pretratamiento del extracto celular con la columna de centrifugado simple usando Phos-tag Agarosa puede mejorar dramáticamente la inmunotransferencia de proteínas fosforiladas con anticuerpos anti-fosfoproteína específicos. Por lo tanto, creemos que el uso de la columna de centrifugado simple con Phos-tag Agarosa es una herramienta poderosa para obtener datos precisos cuando se usan anticuerpos anti-fosfoproteína.

El método Phos-tag Agarosa también es útil para la separación y enriquecimiento de fosfopéptidos de mezclas de péptidos en fosfoproteómica usando espectrometría de masas.

Conclusión

El número de trabajos de investigación que citan el uso de Phos-tag en el 2018 fue de aproximadamente 500 (según los resultados de Google Scholar), lo que indica que Phos-tag está ganando interés como una herramienta estándar para el análisis de la fosforilación de proteínas. Es de destacar que las técnicas basadas en Phos-tag se utilizan no solo para el análisis de fosfoproteínas en la vida general de la investigación científica, sino también para el análisis de fosfoproteínas bacterianas o vegetales que han sido reportadas en relativamente pocos estudios. Además, estas técnicas pueden ser aplicadas para analizar proteínas para las cuales los anticuerpos no están disponibles comercialmente; también para las proteínas a las cuales se les desconoce el estado de fosforilación. Esperamos que más investigadores empiecen a usar estas técnicas basadas en Phos-tag que contribuyen a diversas áreas de las Ciencias de la Vida.

Referencias

1. Kinoshita, E. et al. : Mol. Cell. Proteomics, 5, 749 (2006).
2. Kinoshita, E. and Kinoshita-Kikuta, E. : Proteomics, 11, 319 (2011).
3. Kinoshita-Kikuta, E. et al. : PLoS One, 10, e0132598 (2015).
4. Kinoshita-Kikuta, E. et al. : Int. J. Chem., 4, e1 (2012).
5. Kinoshita-Kikuta, E. et al. : Biochim. Biophys. Acta Proteins Proteom., 1867, 62 (2019).
6. Kinoshita, E. et al. : Anal. Biochem., 438, 104 (2013).
7. Kinoshita-Kikuta, E. et al. : Proteomics, 6, 5088 (2006).
8. Kinoshita-Kikuta, E. et al. : Anal. Biochem., 389, 83 (2009).
9. Yuan, E. T. et al. : Electrophoresis, 38, 2447 (2017).