6 reactivos de laboratorio para la detección de microorganismos

La detección de microorganismos es necesaria para el control de calidad de muestras de alimentos, de agua, de aire; así como para la industria biotecnológica, en el desarrollo de fármacos y la producción de bioderivados. Existen diversos métodos para conocer si una muestra está contaminada por microorganismos, desde métodos más convencionales utilizados desarrollados, hace décadas, hasta reactivos que posibilitan una medida rápida y específica del microorganismo en cuestión, o de alguna sustancia relacionada con su presencia. En este artículo se describen las características de seis reactivos comercializados por la compañía Wako para la detección de microorganismos.

Detección de endotoxina mediante el uso del Test Limulus ES-II de Wako

La determinación de endotoxina es de gran importancia debido al rol de esta sustancia en las enfermedades causadas por las bacterias Gram-negativas. Se conoce como endotoxina a la toxina que es liberada al romperse la pared celular de estas bacterias, que en su mayor parte está formada por lipopolisacáridos. El organismo humano tiene la capacidad de activar una respuesta inmune frente a las cadenas de polisacáridos provenientes de la destrucción bacteriana, pero no actúa contra el lípido A que es el responsable de los efectos sobre la salud que tiene la presencia de endotoxina.

Desde el descubrimiento del ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL), este ha sido ampliamente utilizado en la industria farmacéutica, en control de calidad de alimentos y calidad medioambiental, entre otras numerosas aplicaciones. La concentración de endotoxinas usando este ensayo puede ser medida mediante métodos de coagulación en gel, cromogénicos y cinéticos turbidimétricos.

En los últimos años se han desarrollado test LAL específicos para la endotoxina, pues se descubrió que el β-1,3-glucano y la celulosa interferían en la determinación de endotoxina. El β-1,3-glucano (polisacárido de glucosa presente en la pared celular de setas, bacterias y hongos) activa la cascada de reacciones enzimáticas en LAL por un mecanismo diferente al de la endotoxina. Además solo actúa como interferente cuando se encuentra en bajas concentraciones, en exceso de β-1,3-glucano la medición de endotoxina con LAL es específica a esta.

El uso del Test Limulus ES-2 de Wako permite la cuantificación de endotoxina mediante gelificación o por turbidimetría. A mayor concentración de endotoxina en el medio, menor tiempo de gelificación se obtiene, siendo este un parámetro que puede ser aprovechado para cuantificar la endotoxina presente. Se logra eliminar la interferencia provocada por el β-1,3-glucano, añadiendo Curdlan carboximetilado al buffer ES previamente desarrollado por Wako, de aquí el nombre de este test (ES-II). El Curdlan aporta una concentración de β-1,3-glucanos alta al medio, que hace que no se produzcan interferencias en la medición de endotoxinas.

Curdlan

El Curdlan fue descubierto por Harada y colaboradores al aislar una cepa mutante de Alcaligenes faecalis var. myxogenes 10C3 que producía este polisacárido, con propiedades gelificantes. Su estructura química es la de un polímero de glucosa, con enlaces β-1,3-glucosídicos. El pH óptimo para la formación del gel de este glucano es entre 2 y 3. Las propiedades de Curdlan como gelificante han sido aprovechadas en la industria alimenticia, donde es usado como aditivo, en la construcción y en la industria farmacéutica. Se ha investigado el papel que juega esta molécula en los mecanismos que regulan los procesos alérgicos en humanos, considerándose una droga potencial para tratar esta enfermedad y también se ha estudiado su actividad antitumoral.

El Curdlan es usado como gel de soporte en cromatografía de afinidad, para enzimas inmovilizadas, para filtración, etc. En la detección de microorganismos juega un papel fundamental en el Test Limulus ES-2 de Wako ya que impide la obtención de datos erróneos en la determinación de endotoxina. Su uso en este test se basa en el hecho de que los β-1,3-glucanos actúan como interferentes en la medición de endotoxina solo cuando se encuentran en bajas concentraciones en el medio, pero si su concentración es muy alta no interfieren en la medida. Además el mecanismo que desencadena la cascada de reacciones enzimáticas para obtener el gel de LAL es diferente cuando se activa por endotoxina o por β-1,3-glucanos, posibilitando una medida fiable de la concentración de endotoxina al eliminar la interferencia de β-1,3-glucanos con la adición de Curdlan.

Uso del Test Limulus Color KY para la detección de endotoxinas

Como se ha descrito anteriormente la determinación de endotoxina, usando el ensayo de LAL, puede llevarse a cabo por gelificación o mediante técnicas fotométricas cuantitativas (turbidimetría y colorimetría). El Test Limulus Color KY se basa en la técnica colorimétrica para la determinación específica de la cantidad de endotoxina presente en el medio.

La técnica colorimétrica para la detección de endotoxina consiste en la medición de un cromóforo liberado por un péptido cromogénico al reaccionar la endotoxina con el lisado. La medida cuantitativa se basa en la relación entre la concentración de endotoxina y la cantidad de cromóforo liberado después del tiempo de incubación.

Detección de la micotoxina Patulina

La Patulina es una micotoxina (toxina procedente de los mohos) producida por algunas especies de Penicillium y Aspergillus. Aunque las micotoxinas se conocen principalmente por afectar a los granos esta micotoxina se encuentra en las frutas como la manzana y la pera. Es un patógeno que ataca a la fruta después de cosechada y es resistente a los tratamientos con calor, por lo que puede estar presente en jugos y concentrados de fruta industriales. En realidad esta micotoxina no es especialmente tóxica, pero se ha convertido en un parámetro de análisis de la calidad del zumo de manzana y otros concentrados derivados de esta fruta, pues la presencia en concentraciones mayores a las habituales indica que se usaron manzanas mohosas para la producción del alimento. Se conoce que la principal fuente de contaminación por esta micotoxina es el zumo de manzana. El límite de concentración permitido de patulina es el zumo de manzana y otros concentrados es 50 ppb. Este reactivo sirve como estándar para la medición de Patulina en zumo de manzana y otros concentrados.

Peptidoglicano de Micrococcus luteus

El peptidoglicano es el componente de la pared celular de las bacterias que le proporciona resistencia y estabilidad a estas. Es una estructura cristalina, también conocida como mureína. Este polímero contiene azúcares (residuos de N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico unidos mediante un enlace glicosídico del tipo β-(1,4)) y aminoácidos.

La cantidad de peptidoglicano que se encuentra en la pared celular de una bacteria es una prueba definitiva para clasificarlas como Gram positivas o megativas, debido a que el residuo sólido de la pared celular de las bacterias Gram positivas está constituido en su mayor parte por peptidoglicano, mientras que en las Gram negativas este compuesto es minoritario. Por este motivo el peptidoglicano puede ser un reactivo útil para ser usado como estándar en la detección de microorganismos, además de sus aplicaciones en las investigaciones relacionadas con la industria farmacéutica y biotecnológica.

El peptidoglicano de Micrococcus luteus puede usarse como reactivo estándar para el Set de reactivos SLP de Wako que pasaremos a describir a continuación. Este peptidoglicano causa pirogenicidad y reactividad en el fluido corporal de los gusanos de seda (reactivo de SLP).

Set de reactivos SLP

El set de reactivos SLP comercializado por Wako tiene como finalidad la detección y medida cuantitativa de peptidoglicano y (1→3)-β-glucano. Estas dos sustancias, que forman parte de la pared celular de bacterias y hongos, respectivamente, tienen la capacidad de activar la cascada proteolítica denominada sistema de activación de la profenoloxidasa (proPO). La enzima fenoloxidasa participa en la biosíntesis de la melanina al oxidar compuestos fenólicos a quinonas, que posteriormente se transforman por vía no enzimática en melanina. Este proceso tiene un rol importante en los mecanismos de defensa de los insectos.

En los invertebrados esta cascada de reacciones proteolíticas que convierte la profenoloxidasa en fenoloxidasa se activa en la hemolinfa, tal es el caso del gusano de seda (Bombyx mori). Este kit de reactivos contiene el plasma de la larva del gusano de seda (SLP, silkworm larvae plasma, en inglés, de donde proviene el nombre) en el que se encuentran las proteínas de reconocimiento específicas para peptidoglicano y (1→3)-β-glucano. Los complejos formados por estos compuestos y las proteínas de reconocimiento activan la formación de los precursores de serina-proteasa. Los complejos se unen a la serina-proteasas que inducen la formación de fenoloxidasa.

La cantidad de fenoloxidasa formada, que es proporcional a la cantidad de peptidoglicano o (1→3)-β-glucano presentes en el medio, puede determinarse con el set de reactivos SLP mediante la adición de 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA). La DOPA es oxidada por la fenoloxidasa formando como producto final la melanina, que puede determinada por métodos colorimétricos.

En resumen, Wako ofrece una serie de reactivos que son capaces de detectar bacterias y hongos mediante la formación de melanina. En el caso de necesitar una prueba cualitativa de la presencia de estos microorganismos se puede observar a simple vista por el cambio de color obtenido en la muestra. Si se quiere tener una medida cuantitativa de la cantidad de peptidoglicano o (1→3)-β-glucano presentes se puede usar un instrumento de medida colorimétrica, como el Toxinómetro comercializado por Wako.