16 Anticuerpos monoclonales y sus aplicaciones
¿Qué son los anticuerpos monoclonales? Un anticuerpo monoclonal es aquel que se ha obtenido clonando una única célula madre, mediante alguna técnica que permita aislar las moléculas del anticuerpo que se produce contra un antígeno en específico.
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Partiendo de que se le denomina anticuerpo a las glicoproteínas sintetizadas por los linfocitos T que cumplen la función de defensa en el organismo contra agentes patógenos, desencadenando diferentes respuestas a la presencia de estos agentes llamados antígenos, podemos afirmar que los monoclonales cumplen esta misma función pero son obtenidos en el laboratorio por técnicas de clonación como la dilución al límite.
En el organismo pueden encontrarse anclados a la pared celular o soluble en el plasma sanguíneo, y todos presentan una estructura formada por cadenas pesadas y ligeras con dos sitios de unión al antígeno. Pueden obtenerse mediante la técnica de desarrollo de hibridomas (la más común y la única técnica utilizada en los comienzos) o por técnicas de ingeniería genética (genes híbridos y fagos).
Los anticuerpos monoclonales se clasifican en murinos, quiméricos, humanizados y humanos, según el tipo de cadenas de las que está compuesta la estructura del anticuerpo. Los primeros anticuerpos monoclonales se obtenían a partir de una línea celular de mieloma murino fusionada con células inmunizadas, que son los llamados murinos. Al comenzar a usarse con fines terapéuticos en humanos, para tratar un linfoma, aparecieron los problemas de compatibilidad, pues se secretaban anticuerpos humanos antimurinos. De aquí que se empezaron a sustituir algunas regiones de las cadenas de los anticuerpos por cadenas humanas para lograr así los llamados anticuerpos quiméricos (donde no es humano el sitio de reconocimiento del antígeno, pero el resto del anticuerpo si lo es) y los humanizados (solo es murino un pequeño por ciento de las cadenas hipervariables). Otra técnica que se usa actualmente es usar animales transgénicos, que al portar genes humanos pueden producir anticuerpos humanos específicos para un antígeno, para así lograr los clones y obtener los llamados anticuerpos monoclonales humanos.
Su función en la medicina
Los anticuerpos monoclonales se usan tanto en el tratamiento de diversas enfermedades como en el diagnóstico de muchas otras. Desde el descubrimiento de los anticuerpos monoclonales comenzaron a usarse en ensayos de histocompatibilidad y para diferenciar las células tumorales de las no tumorales. En la mayoría de métodos inmunológicos usados en la actualidad para la detección de enfermedades, están presentes los anticuerpos monoclonales, ejemplo de ello son los agentes patógenos que se identifican haciendo uso de la técnica de ELISA, la presencia de enfermedades que se determina mediante la técnica de citometría de flujo, que hace uso de anticuerpos monoclonales unidos a moléculas fluorescentes, entre otros ensayos inmunohistoquímicos que son ya habituales en cualquier laboratorio clínico. Con el uso de estos anticuerpos se pueden medir los biomarcadores asociados a la trombosis, las reacciones alérgicas producidas en el organismo y en un futuro serán una herramienta clave en el desarrollo de terapias personalizadas.
Para el desarrollo de fármacos también se han usado los anticuerpos monoclonales, en técnicas de purificación fundamentalmente de interferones y en la búsqueda de dianas terapéuticas. Más recientemente se han comenzado a producir fármacos conjugados con anticuerpos que brindan una mayor especificidad y efectividad que los tratamientos convencionales.
En lo que respecta al tratamiento de enfermedades cada día se aprueban más anticuerpos monoclonales que han pasado las fases de ensayos clínicos correspondientes y son aptos para usarse en humanos. Su uso más difundido es para tratar algunos tipos de cáncer como el cáncer de mama, el de colon y linfomas, enfermedades inmunológicas, enfermedades inflamatorias crónicas como la artritis reumatoide y para evitar el rechazo de órganos trasplantados.
Los anticuerpos monoclonales se han utilizado como anticancerígenos empleando diversas técnicas, acoplados a radionucleótidos, que era lo que en sus inicios se conocía como radioinmunoterapia, esta definición actualmente se emplea para referirse a otros métodos donde se combina la inmunoterapia con la radioterapia. Como medicamentos en sí mismos o conjugados con medicamentos también se ha demostrado la eficacia de los anticuerpos monoclonales, logrando una mayor especificidad en la acción del fármaco. Las dianas terapéuticas de los anticuerpos para combatir el cáncer pueden ser los receptores de los factores de crecimiento o los propios factores de crecimiento que al unirse al anticuerpo se inactivan, los antígenos de superficie o directamente la unión a la célula que provoque una respuesta del sistema inmune que induzca la apoptosis.
Para el tratamiento de enfermedades autoinmunes se han usado anticuerpos contra el factor de necrosis tumoral alfa, contra la integrina α4β1 y contra proteínas de superficie. Entre las enfermedades que se pueden tratar con anticuerpos monoclonales está la artritis reumatoide, se ha comprobado que la terapia con anticuerpos anti factor de necrosis tumoral alfa es más efectiva que con otros fármacos convencionales, a pesar del riesgo de padecer infecciones que conlleva.
Para el tratamiento de la esclerosis múltiple la terapia con anticuerpos ya se ha comprobado que es capaz de mejorar la calidad de vida de los pacientes y, aunque queda un camino por recorrer para eliminar los efectos secundarios y hacer más específica la acción de los anticuerpos, se presupone que seguirá siendo la terapia de elección en el futuro.
La enfermedad de Crohn's, enfermedad inflamatoria intestinal que puede causar síntomas muy variados y para la cual no se conoce una cura aún, es tratada desde hace años con anticuerpos monoclonales como el Infliximab que inhibe el factor de necrosis tumoral alfa al unirse al mismo. De este fármaco ya existen estudios de tratamientos a largo plazo y aunque se ha comprobado que su uso no es necesario en todos los pacientes que padecen esta enfermedad y que puede tener variados efectos secundarios, hay un grupo de pacientes en los cuales esta terapia es muy efectiva. Recientemente se ha reportado que otro anticuerpo monoclonal, el Ustekinumab, que actúa por inhibición de las interleucinas 12 y 23, ha sido efectivo para remitir los síntomas de la psoriasis del cuero cabelludo en una paciente con enfermedad de Crohn's, contribuyendo también a la mejora de los síntomas de esta última.
El asma también puede ser tratada con un anticuerpo anti inmunoglobulina E, pues esta enfermedad se produce por acumulación de molécula de IgE secretadas en respuesta a agentes alergénicos a los que está expuesto el individuo. Por ejemplo el Omalizumab es un fármaco que viene siendo utilizado para pacientes con asma de moderada a severa. El tratamiento con este anticuerpo reduce las posibilidades de exacerbación de la enfermedad, incluso se observa la mejora en pacientes que además son tratados con corticosteroides, que es la terapia más asociada a la mortalidad debida al asma. Más recientemente también se han descrito las ventajas que ofrece el uso del Dupilumab, anticuerpo monoclonal anti interleucina 4 y anti interleucina 13, ambas citocinas están involucradas en las rutas fisiológicas de las enfermedades alérgicas.
En el caso del lupus eritematoso sistémico y la artritis soriásica, aunque ya se han realizado ensayos clínicos, las terapias continúan siendo poco eficaces o tienen muchas reacciones colaterales. En estos momentos se están llevando a cabo estudios para definir contra qué tipo de diana terapéutica, es más aconsejable el uso de los anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales también se usan para tratar síntomas relacionados con enfermedades cardiovasculares como la arritmia cardíaca más frecuente (la fibrilación auricular) y las infecciones que pueden afectar a los pacientes con enfermedades coronarias graves como el virus sincitial respiratorio humano. A pesar de que muchas de las reacciones adversas que se presentan con el uso terapéutico de los anticuerpos monoclonales están asociadas a padecimientos cardiovasculares, cada día se reportan más investigaciones del uso de estos anticuerpos para tratar dolencias como la hipercolesterolemia. Aunque muchos son estudios preclínicos sugieren que los anticuerpos son bien tolerados en pacientes con afecciones cardiovasculares, y que presentan un gran potencial como terapia biológica del futuro.
Algunos de los anticuerpos monoclonales que son comercializados por distribuidores de reactivos para la investigación en medicina se describen a continuación:
1. Anticuerpo monoclonal Anti-AGO2 humana
El anticuerpo monoclonal Anti-AGO2 humana puede ser usado para la inmunoprecipitación de la proteína Argonauta2 (AGO2) humana. Además de su uso en inmunoelectroforesis (Western Blot) e inmunohistoquímica. La proteína Argonauta2 forma parte del complejo silenciador inducido por el ARN, conocido como RISC por sus siglas en inglés, RNA-induced silencing complex.
La AGO2 participa en la síntesis de moléculas de microARN, cataliza su unión con los complejos RISC y está involucrada en diversos procesos relacionados tanto con el microARN como con otros tipos de ARN. Este anticuerpo puede ser útil en investigaciones relacionadas con el virus de inmunodeficiencia adquirida en humanos así como en otros experimentos que conlleven la utilización de células madre.
2. Anticuerpo monoclonal Anti Proteína C-Reactiva Humana
La proteína C reactiva humana es una proteína de fase aguda y un mediador de la actividad inmune innata. Esta proteína es un biomarcador cardiovascular, relacionado con la arteriosclerosis y la posibilidad de sufrir infartos de miocardio en pacientes de riesgo, además presenta valores elevados cuando se ha sufrido infartos de miocardio o el paciente presenta enfermedades infecciosas. El anticuerpo anti proteína C reactiva humana es usado en inmunoquímica.
3. Anticuerpo monoclonal Anti AGE conjugado con peroxidasa
Los productos finales de glicación avanzada (AGEs) se originan en el organismo por diferentes rutas metabólicas de azúcares y compuestos dicarbonílicos, que provocan la glicación y oxidación de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. En enfermedades crónicas relacionadas con la edad y otras como la diabetes mellitus ocurre una acumulación de los AGEs, que pueden causar complicaciones en los pacientes. Estudios recientes involucran una respuesta del sistema inmune ante la acumulación de AGEs de proteínas, por lo que se ha aislado este anticuerpo para ser utilizado con fines investigativos.
4. Anticuerpo monoclonal Anti Ago 1 – Investigación del microARN
Usado fundamentalmente para inmunoprecipitación de la proteína Argonauta1 (Ago1) y para la purificación del microRNA que interactúa con esta proteína, capturado por el RISC. La AGO1, al igual que la AGO2, es un componente del complejo silenciador inducido por el ARN (RISC) y está involucrada en numerosos procesos relacionados con en el ARN.
En los estudios bioquímicos se precisa de herramientas como este anticuerpo, que permite eliminar la interferencia de la AGO1 por precipitación, para lograr caracterizar otras proteínas e identificar moléculas de microARN. Este anticuerpo presenta reactividad cruzada con la proteína AGO1 humana y de ratón.
5. Anticuerpo Monoclonal Anti-ASK1
La proteína ASK1 (proteína quinasa reguladora de la señal de la apoptosis 1) juega un papel fundamental en la apoptosis inducida por estrés. La cascada de proteínas quinasas activadas por mitógenos MAPK (por sus siglas en inglés Mitogen-activated protein kinase) son una forma de respuesta intracelular de los organismos a diversos estímulos extracelulares. Existen diferentes componentes en estas vías de señalización, entre lo que se encuentran las MAPK quinasa quinasa que son activadas al interactuar con una proteína G o por fosforilación, esto conduce a una activación de una MAPK quinasa que a su vez activa la MAPK. La MAPKK, o MAPK quinasa quinasa es una familia de quinasas entre la que se encuentra la quinasa reguladora de apoptosis, conocida como ASK1. Este anticuerpo puede ser usado en estudios relacionados con las causas que provocan la sobreexpresión de la proteína ASK1.
6. Anticuerpo Monoclonal Anti-ASK1 fosforilada
El estrés oxidativo induce la desfosforilación del residuo Ser967 y la fosforilación del residuo Thr845, que son dos residuos claves en la acción de esta proteína y en la señalización de la apoptosis. El anticuerpo monoclonal anti ASK1 fosforilada es útil en investigaciones relacionadas con procesos inflamatorios y desórdenes neurológicos degenerativos.
7. Anticuerpo monoclonal Anti-AGO2 de ratón
Al igual que las proteínas Argonautas de origen humano la AGO2 de ratón se ha determinado que es una parte importante del complejo RISC. La AGO2 de ratón participa en la silenciación post-transcripcional de los genes.
Este anticuerpo también se utiliza para inmunoprecipitación, inmunohistoquímica y ensayos de Western Blot.
Presenta reactividad cruzada con la proteína AGO2 de rata y de hamster, de ahí que sea especialmente útil en investigaciones que usan estas especies de animales como modelos.
8. Anticuerpo monoclonal Anti HA tag
HA (YPYDVPDYA) es la hemaglutinina del virus de la gripe A, proteína que utiliza el virus para adherirse a las células que van a ser infectadas. Esta etiqueta es usada para estudios sobre el virus de la gripe A humana, con el objetivo de conocer su mecanismo de acción y desarrollar fármacos que sean efectivos para el tratamiento de la enfermedad.22a Wako también cuenta con el conjugado de peroxidasa – anti HA tag, ambos útiles en la purificación y reconocimiento de proteínas de fusión marcadas con esta etiqueta.
9. Anticuerpo monoclonal Anti GFP
La proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés Green fluorescent protein), aislada de la medusa Aequorea victria o gelatina cristal fue la primera proteína que se usó como marcador fluorescente. Al ser iluminada con luz azul esta proteína fluoresce en el verde, de ahí su nombre. Aunque posteriormente se han estudiado otras proteínas para este fin, esta continúa siendo uno de los marcadores más utilizados en investigación. Se usa para estudiar el rol de una determinada proteína a nivel celular, observar cuando un promotor de una ruta metabólica se activa, ver el crecimiento de neuronas u observar la proliferación de un virus, entre otras aplicaciones. Los avances en las técnicas de microscopía por fluorescencia han hecho de esta proteína una herramienta muy útil de la biomedicina, y gracias a su uso se ha avanzado en el conocimiento de diversos mecanismos fisiológicos. El anticuerpo monoclonal anti GFP desarrollado por Wako proviene de ratón y tiene un amplio espectro de uso desde ensayos de inmunoprecipitación hasta reconocimiento de proteínas en células de C. elegans.
10. Anti P2X4 Anticuerpo monoclonal
Entre los receptores ionotrópicos de ATP se encuentra el P2X4, proteína que participa en los procesos de señalización del dolor cuando hay daños en los nervios periféricos. Se ha demostrado que hay un aumento en la expresión del receptor P2X4 en la microglía después de que han sido dañados los nervios, pero no ocurre este incremento en las neuronas, de aquí que el bloqueo de estos receptores en la microglía se ha convertido en una nueva diana terapéutica para el tratamiento del dolor inducido por lesiones en los nervios periféricos.
El anticuerpo monoclonal Anti P2X4 puede ser usado en investigaciones relacionadas con el dolor neuropático y con patologías cardíacas.
11. Anticuerpo monoclonal Anti GST tag
La glutatión S-transferasa (GST) es la enzima que cataliza las reacciones de reducción llevadas a cabo por el glutatión, que transforma su grupo tiol en un puente disulfuro, con el objetivo de eliminar especies oxidantes que pueden ser tóxicas. Esta enzima y por lo tanto su anticuerpo específico son usados en investigaciones relacionadas con el estrés oxidativo y todas las enfermedades provocadas por esta condición. La GST se integra en vectores de expresión para la obtención de proteínas de fusión, mejorando la solubilidad y aumentando la expresión de las proteínas que llevan la etiqueta.
12. Anticuerpo monoclonal Anti 6xHis tag
En este caso es una cadena de seis histidinas las que son reconocidas por el anticuerpo. La secuencia de seis histidinas lineales pueden coordinar a cationes metálicos divalentes como el níquel y el cobre por lo que esta etiqueta ha sido usada en cromatografía de afinidad principalmente, pero también se usa para la purificación de proteínas mediante inmunoafinidad. Para el reconocimiento de este tag, Wako ha desarrollado cuatro clones que tienen diferentes características y llevan a cabo la unión según la posición de anclaje de la etiqueta, si es a un carbono terminal o a un nitrógeno. Además se ofrece la información para definir que anticuerpo es más recomendable dependiendo de la técnica en la que se va a usar, inmunoprecipitación, ELISA o Western blot.
13. Anticuerpo monoclonal Anti-α-Sinucleína fosforilada
El agregamiento de la α-Sinucleína, proteína presente en los cuerpos de Lewy, está asociado con la enfermedad de Parkinson y la demencia con cuerpos de Lewy. La fosforilación de la α-Sinucleína en el residuo Ser129 es una de las causas del mal plegamiento de esta proteína y promueve la agregación. El anticuerpo monoclonal Anti-α-Sinucleína fosforilada comercializado por FUJIFILM Wako es específico para la α-Sinucleína humana fosforilada en el residuo Ser129 y no reacciona con la α-Sinucleína humana no fosforilada. Este anticuerpo puede ser utilizado en investigaciones relacionadas con la enfermedad de Parkinson y la demencia por cuerpos de Lewy, por ejemplo para análisis de Western blot y otras técnicas de inmunohistoquímica.
14. Anticuerpo monoclonal Anti c-Myc tag
La secuencia que reconoce este anticuerpo es de diez aminoácidos EQKLISEEDL, que forman parte del oncogén humano myc. Esta secuencia es usada como tag en las proteínas de fusión, siendo una herramienta muy efectiva para la localización de proteínas, técnicas de ELISA, inmunoquímica y purificación de proteínas. El anticuerpo monoclonal anti c-myc tag comercializado por Wako ha sido probado en análisis por Western blot y en inmunoprecipitación de proteínas con esta etiqueta con muy buenos resultados en ambos casos.
15. Anticuerpos monoclonales Anti tags
Una técnica que ha ido ganando popularidad en las investigaciones biomédicas es la de usar etiquetas o tags para el marcaje de proteínas cuando se quieren unir a un anticuerpo y no existe el anticuerpo específico para esta proteína, o la proteína se encuentra en un medio donde se hace difícil su reconocimiento. Estas etiquetas son epítopos (parte que reconoce el anticuerpo de un antígeno) de diferente naturaleza química, péptidos, proteínas, azúcares, entre otros. Los anticuerpos que se presentan a continuación tienen en común que todos son anti tags. Esta herramienta es clave en todas las investigaciones relacionadas con proteínas de fusión, que son aquellas que se obtienen para investigaciones biomédicas o con fines terapéuticos, por la fusión de genes que codifican para diferentes proteínas.
16. Anticuerpo monoclonal Anti DYKDDDDK tag
La cadena peptídica DYKDDDDK se usa como etiqueta para la detección y purificación de proteínas recombinantes de fusión. Esta etiqueta, conocida como Flag tag, por su nombre patentado por Sigma-Aldrich Co., fue una de las primeras en usarse para la tecnología de ADN recombinante y permite el reconocimiento y purificación de muchas proteínas para las que no se cuenta con un anticuerpo específico. El anticuerpo monoclonal anti DYKDDDDK tag presenta una alta especificidad y se logra una buena reproducibilidad de los ensayos en los que interviene, además de tener la ventaja de ser un producto económico. Puede ser usado en análisis de Western Blot para la detección de proteínas de fusión marcadas con esta etiqueta y para inmunoprecipitación. Además Wako cuenta con el conjugado anticuerpo anti DYKDDDDK tag – peroxidasa.
