10 métodos de extracción de ADN

La extracción de ADN se realiza para obtener las moléculas aisladas con alto grado de pureza y poderlas utilizar en investigación científica, en medicina o para la ciencia forense.

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La mayor parte de los métodos que existen para extraer el ADN consisten en lograr primero la lisis o ruptura de la célula, para luego separar las moléculas de ADN del resto de los constituyentes de la célula.

A la hora de escoger que método de extracción de ADN utilizar se tienen en cuenta varios factores:

• La cantidad de muestra de la que se dispone para extraer el ADN.
• El tipo de muestra o fuente de la que se quiere obtener el ADN.
• La pureza con la que se quiere obtener el ADN extraído.
• El tiempo que consume cada método, su costo y el rendimiento esperado.
• Uso que se le va a dar al ADN extraído.

Con la diversidad de métodos conocidos actualmente se puede extraer ADN de muchos sustratos como son la sangre, la saliva, la orina y otros fluidos corporales, tejidos vivos, cultivos celulares, líquido amniótico, entre otros. En este trabajo se analizan las diferencias, ventajas y desventajas de algunos de los métodos existentes para la extracción del ADN.

Incubación del lisado para su uso

Una posible forma de aislar el ADN genómico es incubar el lisado crudo a temperaturas entre 90 – 100 ºC y luego usarlo directamente. Es evidente que mediante este método el ADN obtenido es de muy baja pureza y con aplicaciones muy reducidas. Otra desventaja de este método son las pérdidas de ADN por acción de las nucleasas y otros componentes de los orgánulos que están en contacto con el ADN y pueden destruirlo, por lo que no es útil para almacenar el ADN pues los contaminantes pueden degradar las moléculas de ADN.

Lisis por ruptura mecánica y extracción con disolventes orgánicos

Si se opta por realizar el lisado de las células mediante un proceso mecánico hay que tener en cuenta la posibilidad de ruptura de las moléculas de ADN que se intentan separar, por lo que este debe bastar para lograr la lisis de las células pero no ser muy agresivo para proteger el ADN. Este método puede ser usado para extraer ADN de material crudo, liofilizado o congelado, que puede romperse con un mortero, por congelación-descongelación o usando ultrasonidos. El lisado de células se puede extraer con cloroformo, alcohol isoamílico o fenol, siendo las proteínas y otros componentes de la célula solubles en el disolvente orgánico, por lo que de esta forma se logra la separación de los ácidos nucleicos. Este método se puede usar para moléculas de ADN de alto peso molecular, obteniendo buenos rendimientos de moléculas relativamente puras, siempre teniendo en cuenta que hay que controlar el pH de la fase acuosa y la concentración de sales, que son los factores que aseguran una buena separación. Las desventajas de este método son el uso de disolventes orgánicos dañinos para la salud humana y que pueden quedar como trazas en la muestra de ADN y luego actuar como interferentes en técnicas como el PCR, que es largo, en ocasiones puede dar rendimientos poco reproducibles y requiere de varios trasvases que aumentan la posibilidad de contaminación de la muestra.

Lisado y purificación con un detergente iónico. Método del CTAB

Este es un procedimiento básico para extraer ADN de vegetales, donde un detergente aniónico puede romper la pared celular y así se produce la lisis de las células. El uso de detergentes aniónicos no solo se restringe a la extracción de ADN vegetal, puede ser usado para ADN genómico de bacterias y otros tipos de organismos. Un ejemplo de este método, quizás el más conocido, es el uso de CTAB (bromuro de cetil trimetil amonio) como detergente para lograr la lisis. El CTAB además, en presencia de EDTA como agente quelatante y TRIS-HCl como tampón, forma complejos insolubles con el ADN. Luego se extraen los residuos orgánicos con cloroformo, para separar posteriormente el ADN por precipitación con etanol. Si se quiere evitar el uso de disolventes orgánicos se puede llevar a cabo el método del CTAB separando directamente los complejos insolubles formados con el ADN del sobrenadante donde han quedado disueltos el resto de componentes celulares. Estos complejos se resuspenden en disolución salina y se adiciona posteriormente alcohol y RNAsa, logrando que precipite el ADN con un grado de pureza aceptable para muchas aplicaciones.

Método de salting-out

A partir de un lisado celular se pueden separar las moléculas de proteínas y otros contaminantes del ADN mediante la adición de altas concentraciones de sal que hacen que disminuya la solubilidad de las moléculas orgánicas en la fase acuosa. En este método se utiliza frecuentemente la proteinasa K, el TRIS-HCl para regular el pH y otros reactivos químicos que aseguren la total inactivación de las enzimas que pueden actuar sobre las moléculas de ADN. Para la extracción se utilizan sales inorgánicas como el perclorato de sodio y el cloruro de sodio en concentraciones muy altas que hacen precipitar a las moléculas orgánicas. El precipitado formado se separa por centrifugacón y luego se puede extraer el ADN de la disolución acuosa mediante la adición de alcohol, por precipitación.

Este método es sencillo, pero no siempre es eficaz, por lo que el ADN obtenido en muchas ocasiones debe ser purificado antes de ser usado en posteriores aplicaciones. La ventaja es que se elimina el uso de disolventes orgánicos.

Uso de la proteinasa K y el dodecilsulfato de sodio

El procedimiento conocido como PK-SDS por sus siglas en inglés proteinase K - sodium dodecyl sulfate, es uno de los más usados para la extracción de ADN ya que la digestión de la muestra se puede realizar con proteinasa K que es activada por el dodecil sulfato de sodio. La proteinasa K inactiva las DNAsas presentes en el lisado celular usando detergente aniónico el SDS. La proteinasa K también es usada en otros de los métodos descritos en este artículo para la digestión de las proteínas y otros contaminantes del lisado celular.

Método de extracción de ADN con yoduro de sodio como agente caotrópico en un único tubo

La compañía Wako pone a disposición de los investigadores y empresas varios kit de ADN que usan yoduro de sodio como agente caotrópico, que tienen la ventaja de que la extracción se realiza en un único micro tubo de centrifugado. El yoduro de sodio además de provocar la lisis celular rompe la capa de hidratación que rodea el ADN y logra que las cargas negativas de los grupos fosfatos del ADN queden más expuestas. En estos kits después del tratamiento de la muestra con yoduro de sodio en el mismo tubo se adicionan detergentes aniónicos como es el caso del N-lauril sarcosinato de sodio, proteinasa K y/o otros reactivos que permiten separar las proteínas y lípidos contenidos en las muestras biológicas del ADN.

Entre los kits comercializados por Wako se encuentran:

• Kit de extracción de ADN (DNA Extractor® Kit) para extraer ADN tanto de suero sanguíneo como de productos biofarmaceúticos.
• Kit de extracción de ADN WB ( DNA Extractor® WB Kit) para la extracción de ADN genómico de muestras de sangre entera
• Kit de extracción de ADN TIS (DNA Extractor® TIS Kit) este kit puede ser usado para la extracción de ADN de tejido parenquimatoso humano y animal.
• Kit de extracción de ADN SP (DNA Extractor® SP Kit) usando este kit se puede extraer el ADN libre del suero y plasma sanguíneo
• Kit aislador de ADN PS (DNA Isolator PS Kit) permite aislar el ADN en muestras de secciones de tejidos embebidas o incrustadas en parafina.
• Kit de extracción de ADN FM (DNA Extractor® FM Kit) su principal uso es la obtención de ADN en muestras de medicina forense.

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Extracción con gradientes de cloruro de cesio – bromuro de etidio

El ADN genómico puede ser purificado por centrifugación selectiva a través de la generación de gradientes de cloruro de cesio. Primeramente se lleva a cabo el lisado celular por métodos mecánicos o químicos y la mezcla es centrifugada durante varias horas en presencia de bromuro de etidio. Como hay bromuro de etidio en el medio, se pueden visualizar las diferentes capas en las que se agrupan los ácidos nucleicos según su densidad con luz ultravioleta. Se obtienen varias capas que pueden separarse y recuperar el ADN purificado.

Este método a pesar de dar como resultado un ADN de alta calidad tiene una serie de desventajas: es largo, imposible de automatizar, caro, requiere una ultracentrífuga y usa compuestos químicos tóxicos.

Intercambio aniónico para la extracción de ADN del lisado celular

La cromatografía en fase sólida de intercambio aniónico se basa en la interacción que se establece entre los grupos fosfatos cargados negativamente del ADN y la matriz molecular con que se compacta la columna. Esta interacción hace que las moléculas de ADN queden retenidas en la fase estacionaria de la columna y puedan separarse de las proteínas y demás metabolitos presentes. Luego añadiendo una alta concentración de sales a la fase móvil se logra eludir el ADN, que si es necesario es precipitado con alcohol para futuras aplicaciones, si no puede utilizarse directamente disuelto en el buffer con sales en el que se elude. Este método tiene la ventaja de evitar el uso de disolventes orgánicos tóxicos y es más simple que los que requieren precipitación de otros componentes para su separación del ADN.

Uso de matrices celulósicas para la extracción del ADN de muestras biológicas

Un método usado en investigaciones forenses consiste en impregnar una matriz de celulosa con productos químicos que permitan la lisis celular y posterior conservación del ADN. Para esto se unen tampones, agentes quelatantes, sales, detergentes y moléculas con gran absorbancia en el UV para proteger las muestras de los radicales libres que pueden formarse por exposición a la luz solar. Siguiendo este procedimiento las muestras pueden ser conservadas por un largo período de tiempo, lo cual es muy útil para la resolución de casos forenses y también tiene utilidad para la determinación de especies en un fluido corporal como puede ser un virus o una bacteria.

Uso de resinas de intercambio iónico

Para la extracción del ADN también se han diseñado resinas que son capaces de formar complejos con el ADN. El uso de resinas hidrocarbonadas con estructuras rígidas en tres dimensiones permite que la superficie se encuentre cargada con alguna sustancia como el dietilaminoetilo que puede protonarse en medio ácido y quedar cargado positivamente por lo que interacciona con los grupos fosfatos del ADN. Esto es un método directo, que puede realizarse en un solo tubo y relativamente rápido, pero tiene como inconveniente que se aíslan cadenas sencillas de ADN, y este no puede ser utilizado por ejemplo para el análisis de la variación de polimorfismos en fragmentos de restricción (RFLP)